Съдържание
- етапи
- Метод 1 Идентифициране на бактерия чрез оцветяване по Грам
- Метод 2 Извършете теста за оцветяване на Ziehl-Neelsen
- Метод 3 Проучете поведението и външния вид на бактериите
- Метод 4 Интерпретирайте всички резултати
Идентифицирането на бактериите е сложна задача. Една от причините е, че според изчисленията в света има между 10 000 и 1 милиард бактериални вида! Правилното идентифициране на бактериите е много важно, особено в медицинската област, където правилното лечение на заболяване зависи до голяма степен от вида на микроба, който причинява проблема. В повечето случаи идентификацията се извършва въз основа на елиминирането. За да идентифицирате бактерията, трябва да извършите тестове за оцветяване, да анализирате външния й вид и да наблюдавате как тя реагира добре на различни условия. Ако имате нужда от бърз резултат, вземете ДНК проба, която да изпратите в лаборатория.
етапи
Метод 1 Идентифициране на бактерия чрез оцветяване по Грам
- Определя ако бактериите са грам положителни или отрицателни. Оцветяването по грам е метод за разделяне на бактериите между двата най-често срещани типа: грам положителни и грамотрицателни. Първите имат плътна клетъчна стена, състояща се от полимер, наречен пептидогликан, който има най-добро оцветяване като тънките стени на грам-отрицателни бактерии.
- Някои често срещани видове грам-положителни бактерии са стрептококи, стафилококи, микрококи (или микрококи) и листерии.
- Ето някои често срещани примери за грамотрицателни бактерии: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium и Campylobacter.
- Вземете подходящи защитни мерки. Бактериите и химическите елементи, които ще използвате по време на теста, представляват риск за вашето здраве. Носете предпазни очила, ръкавици за нитрилни еднократна употреба и лабораторно покритие, когато извършвате теста за оцветяване. След като сте готови, поставете ръкавиците и всички други замърсени материали в специална торба. Не забравяйте да следвате процедурите на вашата лаборатория, за да се отървете от торбата за замърсени продукти.
- Поставете пробата за наблюдение върху стъклен слайд. За да започнете теста, поставете капка или бактериален образец върху стерилна пързалка. След това плъзнете острието върху горелка Bunsen, запалена три пъти, за да фиксирате пробата и да предотвратите излизането й от чинията, когато изплакнете или добавите реагентите.
- Добавете 5 капки лилав кристал към острието. Изсипете пет капки кристално виолетов разтвор върху пробата. Изчакайте малко, за да може пробата да абсорбира кристалната виолетка.
- Дръжте острието на място с щифтове за дрехи, за да не оцапате ръцете си.
- Измийте добре ножа, за да премахнете петното. Използвайте чешмяна или изстискваща бутилка и оставете водата да тече много бавно до пет секунди, за да премахнете остатъците от мастило, които не са се залепили върху пробата.
- Изсипете пет капки грам диодно петно върху пързалката. Това е разтвор, състоящ се от диод, натриев бикарбонат и калиев диодид, който кара кристалната виолетка да се стопи с клетъчните стени на бактериите. Изсипете пет капки от разтвора върху пробата и оставете за една минута.
- Пробата се промива с алкохол или млечна киселина. Алкохолът и лацетонът са избелващи агенти и ще премахнат оцветяването на бактериалните клетъчни стени, ако са грамотрицателни. Изсипете няколко капки белина върху пробата и оставете да подейства не повече от три секунди. След това, опитайте да изплакнете внимателно с вода в продължение на пет секунди, за да премахнете тези избелващи средства.
- Ако оставите белина да действа дълго време, това може да доведе до изчезване на оцветяване по грам-положителни бактерии, което води до фалшиво отрицателно.
- Извършете контрастен тест със сафранин. Сафранинът е червено багрило, което контрастира на кристала с виолетово, като по този начин оцветява бактериите, незасегнати от лилаво оцветяване. Изсипете около пет капки сафранин върху пробата и оставете за една минута. След това, опитайте да изплакнете леко с вода в продължение на пет секунди.
- Визуализирайте пробата си с 1000X увеличение. Бактериите ще станат лилави или лилави, ако са грамположителни, или розови, ако са грамотрицателни заради сафранина.
Метод 2 Извършете теста за оцветяване на Ziehl-Neelsen
- Използвайте тази техника, за да откриете киселинно бързите бактерии. Тези видове съдържат по-голямо количество липиди, което ги прави по-устойчиви на багрилата, използвани при оцветяването по Грам. Киселинноустойчивите бактерии принадлежат към рода Mycobacterium, който включва бактерията, отговорна за туберкулозата (M. tuberculosis). За да оцветите бактерия, устойчива на киселини, трябва да използвате червено багрило, наречено карболов фуксин, устойчиво на изплакване с разтвори на кисели или сярна киселина.
- Вземете подходящи защитни мерки. Химическите и биологични материали, използвани по време на оцветяването на Ziehl-Neelsen, могат да бъдат опасни. Освен това ще трябва да използвате източници на топлина, като накрайник Bunsen, електрически нагревател или алкохолна лампа. Следвайте инструкциите по-долу, за да извършите теста.
- Облечете очила, нитрилови ръкавици и лабораторно палто.
- Внимавайте да не вдишвате изпарения от багрила и избелвания и не позволявайте на капчици да разпръскват очите или кожата ви. Дръжте контейнерите отворени под капак.
- Бъдете много внимателни, когато затопляте острието. Повечето от използваните химикали са запалими. На слайдовете или друго оборудване може да има следи от запалими вещества.
- Подгответе острието. С кръгови движения равномерно разпределете малко количество от бактериалната проба в центъра на стерилна пързалка. Вашата проба трябва да заема около 10 mm на 20 mm.
- Изсушете острието. Поставете острието върху сушилната конструкция с образеца, обърнат нагоре. Оставете да изсъхне естествено за 30 секунди. Не се опитвайте да изсушите острието с кърпа.
- Закрепете пробата с топлина. С образеца нагоре плъзнете острието два или три пъти върху запалена Bunsen горелка. Можете също така да поставите острието на електрически нагревател, като настроите температурата между 65 ° C и 75 ° C за най-малко два часа. Внимавайте да не заври или изгори пробата.
- Добавете карболния фуксин към острието. Изсипете няколко капки от този разтвор върху пързалката. Изсипете достатъчно, за да покриете напълно пробата.
- Загрейте острието, за да фиксирате багрилото. Затоплете внимателно плъзгача върху горелка Bunsen или алкохолна лампа с пробата, насочена нагоре, или я поставете на електрически нагревател. Загрейте острието до 60 ° C или докато започне да отделя пара. Оставете багрилото да действа в продължение на пет минути.
- Ако използвате електрически нагревател, включете го на 60 ° C. Ако изберете лампата за алкохол или горелката Bunsen, трябва да очаквате да видите изпарения.
- За да поддържате острието при желаната температура в продължение на пет минути, затоплете го периодично.
- Внимавайте пробата да не заври, изгори или изсуши.
- Изплакнете острието със студена вода. Оставете го да се охлади пет минути и внимателно изплакнете няколко секунди с бистра вода. Използвайте вода от чешмата или бутилка за изстискване, за да премахнете петна от багрила, които не са се залепили върху пробата.
- Изсипете върху пробата кисел алкохол или сярна киселина. Използвайте обем 3 обемни (об. / Об.) Алкохол или 20% сярна киселина, за да покриете напълно пробата. Оставете киселината да действа, докато цветът избледнее и достигне много ярко розов нюанс. Процесът обикновено отнема около десет минути.
- Използвайте чиста вода за изплакване на острието. Внимателно измийте острието под кран или с помощта на бутилка за изстискване. Отстранете добре всички остатъци от киселина и багрило.
- Добавете контрастния агент. След като изплакнете пързалката, изсипете багрилото от малахитово зелено или метиленово синьо. Тези две разтвори създават синкав или зеленикав фон, върху който ще се появи червеното багрило, както и други биологични материали, като човешки клетки и некиселинно устойчиви бактерии. Оставете веществата да действат една до две минути.
- Изплакнете и подсушете острието. Изплакнете обилно с вода, за да премахнете излишния контраст. След като сте готови, подсушете гърба на острието със суха кърпа и оставете да изсъхне естествено на стойка.
- Визуализирайте пробата си с 1000X увеличение. Киселоустойчивите бактерии ще станат червени или тъмно розови. Други бактерии, небактериални клетки и основата на острието ще станат зелени или сини.
Метод 3 Проучете поведението и външния вид на бактериите
- Анализирайте формата на бактериите. След извършване на теста за оцветяване, за да се определи дали бактериите са грам-положителни, грам-отрицателни или киселинно-устойчиви, е време да се идентифицират по-точно вида. Първо, анализирайте формата на бактериите на пързалката. Трите най-разпространени форми са коки (сферични), спирали и бацили (форма на пръчки).
- Има няколко варианта на тези форми. Бактериите с кръгла форма (кокус), например, могат да се появят по двойки (диплококи), във вериги, на купища или в групи от четири (тетради).
- Разберете дали бактериите са аеробни или анаеробни. Вземете две проби от бактерии и създайте две отделни култури. Луната трябва да е анаеробна (отглеждана без кислород), докато другата трябва да е аеробна (отглеждана с кислород). Съхранявайте анаеробната култура при 35 ° С на място без кислород най-малко 48 часа, преди да наблюдавате растежа.
- Ако бактериите растат в среда без кислород, но не и когато са изложени на кислород, това означава, че те са анаеробни.
- Въпреки че се развиват в среда с кислород, но не и при липса на кислород, те са аеробни.
- Когато те се развиват и в двете среди, говорим за факултативни анаеробни бактерии.
- Извършете тест за подвижност. Бактерията е мобилна, ако може да се движи сама с една или повече жлези. Степента на подвижност е много важна при идентифицирането на някои видове бактерии. Има няколко вида подвижност, но най-сигурният и четлив начин е полутвърдата среда.
- Създайте култура за теста за подвижност. Пригответе култура от бактерии в бульон за култура. Следвайте инструкциите по-долу, за да приготвите бульон по ваш избор.
- Културата се инокулира в полутвърд агар за тестове за подвижност. Покрийте част от бульонната култура със стерилна игла за инокулиране. Внимателно засадете иглата в полутвърдата тръба с дагър, като TTC lagar, която сте подготвили за теста. Иглата трябва да проникне 2/3 от агара.
- Когато приключите, внимателно извадете иглата, като внимавате да не надхвърлите границите на зоната на инокулация.
- Инкубирайте епруветката при 30 ° С в продължение на 48 часа.
- Прочетете резултата от теста. Агарът за теста за подвижност ще се зачерви при контакт с бактерии. Ако те са подвижни, този червен или розов оттенък ще се разпространи по цялото вещество. В противен случай оцветяването ще бъде ограничено до мястото на инжектиране.
Метод 4 Интерпретирайте всички резултати
- Съберете коментарите си. За да знаете вида на бактериите, ще трябва да съберете информацията, получена от културите, тестовете за оцветяване и наблюдението на формите. Ако изследвате пробите на пациента, симптомите, които те представят, могат също да помогнат да определите вида на бактериите, който е подходящ.
- Например, ако тестовете покажат, че бактериите са грам-отрицателни, анаеробни, неподвижни и забележите симптоми като болка в корема, гадене и повръщане при пациента, вероятно пациентът страда от инфекция с Bacteroides. Fragilis.
- Консултирайте се с база данни. В света има хиляди видове бактерии. Невъзможно е да знаеш всичко наизуст. Вероятно ще се наложи да се консултирате с клинична книжка по микробиология или онлайн база данни, за да сравните резултатите от тестове с информация за бактериални видове.
- Има отлични онлайн ресурси за идентифициране на бактерии, но повечето от тези бази данни са достъпни на английски език, включително Patricbrc.org и GlobalRPh. Все пак можете да намерите полезна информация на уебсайта на Международния център за микробни ресурси на INRA.
- Направете генетичен тест, за да знаете точните видове бактерии. В някои случаи може да се наложи да идентифицирате бактериалните видове. Най-бързият и лесен метод е да се извърши ДНК тест. ДНК тестовете също са полезни за идентифициране на бактерии, устойчиви на традиционните форми на оцветяване и култура. В наши дни ДНК тестовете за микроорганизми са много бързи и могат да бъдат готови за по-малко от два часа.
- Ако нямате достъп до лаборатория, която извършва генетично секвениране на микроорганизми, изпратете бактериална проба в специализирана агенция.